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我的實習實驗申請書
（１）研究動機與研究問題
山螞蝗為台灣常見的中草藥,有多項分類，例如大葉山螞蝗，小葉山螞蝗。當中大葉山螞蝗在民間常用於敷用跌打損傷，止痛消腫。另外還有當綠肥之用途。大葉山螞蝗學名為Desmodium gangeticum (L.) DC.。為豆科(Leguminosea)山螞蝗屬(Desmodium)主要分布為熱帶亞洲，在臺灣中南部低海拔灌叢中。台中、南投、台南高雄、屏東、台東，平野至山麓至中、低海拔林內都可以發現他的蹤影。為了更了解山螞蝗屬植物的生藥資源，本研究針對大葉山螞蝗進行植物生藥學研究。包刮外佈形態鍵定(像是花,葉,果實,種子,花粉等等)確定其植物特徵，可以當作植物基原鑑定的參考。另外PCR技術的練習與應用。也同時是位大葉山螞蝗做更深一層的探討與了解。
針對植物外部的型態利用一般的數位相機，光學與電子顯微鏡觀察。針對花，果實，種子以及其花粉型態進行瞭解與鑑定；內部構造的組織切片，確定其內部細胞構造及特徵。
再來是PCR技術，rDNA ITS序列是近年用來探討植物種內變異與種間，近緣屬間分子系統關係的重要分子標記之一，隨著時代進步，利用基因體定序資料庫來鑑識植物基原成為一個新的趨勢。高等植物的核糖體DNA是由串連重複排列的單位組成，每個單位包刮編碼區和轉錄間區隔，編碼區包刮18S、5.8S及26SrRNA等三個基因序列是高度保守的。另外在rDNA之序列結構中，在18S、5.8S和26SrRNA基因區中之序列，在不同物種之間相當一致；但在ITS和IGS的區域中，不同物種之長度及序列常有很大變異，可以用來鑑別不同之物種。ITS區序列速度較快，其速度恰與近緣種較一致。因此被廣泛用於高等植物近緣種的鑑別。
以聚合酶反應擴增部份核糖去氧核糖核酸區域之ITS1、5.8S、ITS2產物複製產物長為821bp。將此序列送入基因庫進行比對，證實此DNA片段為rDNA之ITS區域。換言之就是利用聚合酶連鎖反應(PCR)技術，將山螞蝗屬植物rDNA的ITS區域加以複製近一步的分析及定序，得到其部份DNA的序列，整合這些基礎，一定可以在基因鑑定上有更多的了解，以便於日後的藥材鑑定以及臨床研究的參考。減少誤用與濫用的情形。
（２）研究方法
一、外部形態鑑定部分
植物採集
本實驗採集新鮮大葉山螞蝗，標本存放在台中市國立自然科學博物館
實驗材料
植物體
花
果皮、種子
花粉粒
實驗試劑
Acetolysis 所需試藥
10% HCl
10% KOH
H2SO4 (concentrated)
Acetolysis solution：是由 10 ml的sulphuric acid和90 ml
的 acetic anhydride混合而成
Hydrofluoric acid
95% Ethanol
儀器
顯微鏡 Olympus
數位相機 Nikon 4500
鍍金機 JFC-1100E，日本Jeol
電子式掃描顯微鏡 JSM-5400，日本Jeol
Acetolysis 所需器材
離心管
水浴鍋
10 ml和100 ml 量筒
攪拌棒
二、植物組織切片部分
１、實驗試劑：
Chloral hydrate solution
Glycerin : water（1 : 1）
Glycerin : alcohol : water（1 : 1 : 1）
Phloroglucinol solution
Potassium chlorate
Iodine test solution
Hydrochloric acid（12 N）
Potassium hydroxide（50 ％）
Safranine
SudanⅢ solution
２、儀器：
顯微鏡（OPTIMA G303）及照相設備
立體顯微鏡（OPTIMA ZM160AT）及照相設備
顯微測微計（Erma 0.01 mm Micrometer）
照相機（Nikon COOLPIX 5900）電腦及其周邊設備與相關軟體
實驗步驟
一、植物外觀
利用外觀鑑別並以數位相機拍攝。
二、花
從植物體上取下花後，1小時之內以20倍Olympus顯微鏡觀察，以數位照相機拍攝。
三、果皮、種子
(1) 風乾後以顯微鏡觀察之
(2) 以鍍金機真空鍍金後以電子顯微鏡觀察之
四、花粉粒
(1) 取花粉粒
取花粉粒須先經由acetolysis (Erdtman 1952)50步驟處理。
Acetolysis步驟：
將經過乾燥處理之樣品放入試管
加入10% HCl (去除carbonates)
以蒸餾水稀釋 (distilled water)
離心後除去上清液
重複3，4步驟兩次
加入10% KOH (去除一些有機物)
以蒸餾水稀釋
離心後除去上清液
重複7，8步驟兩次。
加入冰醋酸
離心後除去上清液 (如果有明顯的雜質則重複步驟2~11)
加入acetolysis solution (去除有機雜質，製備花粉粒)
水浴15 min
從水浴鍋拿出，靜置至室溫
以蒸餾水稀釋
離心後除去上清液
至無色（如仍有顏色則重複步驟15-16）
加入95% alcohol
離心後除去上清液
加入95% alcohol
(2) 電子顯微鏡觀察：
置備好的花粉粒，先置於95% alcohol中，以滴管吸取滴於載波片上，乾掉後標號置於玻片保存盒中，使用時，剪取鍍碳膠帶合適大小，黏貼於銅座上，然後在載玻片上稍微黏取，得到花粉粒，之後將銅座置於鍍金機鍍金（電流10 mA 1 min*2），以掃瞄式電子顯微鏡觀察之。
三、生藥組織鑑別：
(1) 將採集之莖及葉，利用徒手切片法進行
橫切（transverse section，X.S.）
徑縱切（radial longitudinal section，R.L.S.）
弦縱切（tangential longitudinal section，T.L.S.）
(2) 置檢體於載玻片上，先以 chloral hydrate solution 清除細胞內容
物後，再滴加各種不同化學染劑。內部組織構造之記載及說明，以橫
切面為主。
特殊組織之觀察以下列方法處理之：
phloroglucinol solution 與hydrochloric acid進行木化反應。
以sudanⅢ染色，再以glycerin：alc：water（1：1：1）混合溶
液清洗之，觀察木栓化反應。
利用 Schultze's 與 KOH maceration method 將材料予以加熱解
離，最後以 glycerin：water（1：1）， 當做封鎖劑，觀察其細
胞解離情形。
二、顯微鏡觀察
先用低倍鏡頭檢查檢品之弱擴大圖，再用高倍鏡觀察內部組織之特徵，
使用顯微測微計測量各組織或其細胞大小。並利用顯微鏡之照相設備，
將鑑別所需組織照相以供鑑定之用。
四、PCR之研究
１、植物材料與DNA 之抽取
本實驗之材料採集大葉山螞蝗植物新鮮葉子，標本存放在國立自然科學博物館植物標本館(TNM)。 實驗所得DNA之序列登錄於 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene bank中。
葉片組織在液氮中研磨粉碎後貯藏於 -20 ℃下備用。DNA 之抽取使用Dellaporta method51。
(1) 磨碎萃取：
取1~4 g幼嫩葉於研缽內，以液態氮研磨成粉末，移置於離心管中。
加入 15 ml 之Extraction buffer及1 ml 20 % SDS，強力搖晃 50 次使之混合，接著以65oC水浴10分鐘。
加入5 ml之 potassium acetate solution， 強力搖晃約 50 次後冰浴 20 分鐘。
(2) 異丙醇沉澱：
在 12 krpm（4 oC）離心 20 分鐘，取上清液至新離心管，加入10 ml之異丙醇在–20 ℃下約 5~10分鐘，使之沉澱。
在12 krpm（4 oC）離心15分鐘，去掉上清液，倒立10分鐘，呈乾燥凝膠。
加入0.5 ml之 TE buffer，重新將凝膠溶出呈懸浮液。
(3) 酚清洗：
將懸浮液倒入收集管，加入等量（0.5 ml）phenol（pH 8.0）混勻，在10 krpm（4 ℃）離心 5 分鐘。
將上清液倒入新收集管，加入0.25 ml chloroform（chloroform： isoamylalcohol=24：1）和0.25 ml phenol混勻，在10 krpm（4 ℃）離心 5 分鐘。
將上清液倒入新收集管，加入0.5 ml chloroform混勻，在10 krpm（4 ℃下）離心 5 分鐘。
(4) 酒精沉澱：
將上清液倒入新收集管，加入0.9 ml absolute EtOH和0.15 ml ammonium acetate（7.5 M）。
將混合液置於–20 ℃下30分鐘加強沉澱作用，在10 krpm（4 ℃下）離心15分鐘，去掉上清液，倒立5~10分鐘。
再以70 % EtOH清洗，置於室溫下15 分鐘。
(5) 真空乾燥：
在10 krpm（4 ℃下）離心 5 分鐘，去掉上清液，抽氣至完全乾燥。
(6) TE溶解：
加入TE緩衝液（10：1）0.2 ml溶解產物。
酌量加入RNase A（10 mg/ml），分解及處理RNA。
保存於–20 ℃以供使用。
２、聚合酶連鎖反應( PCR )
DNA 通常為雙股，呈相反方向結合。其中一股為5'（指核苷酸（Nucleotide）分子中五碳醣的第五個碳的方位）→ 3'， 另一股為 3'→ 5'。DNA 係由核苷酸包括：腺嘌呤（adenine）（A）、鳥糞嘌呤（guanosine）（G）與胞嘧啶（cytosine）（C）及胸腺嘧啶（thymine）（T）所組成。且在配對氫鍵結合時均為A對T，G對C。
選取特定引子18D和28CC，利用PCR複製核糖體核酸基因間隔區(ITS)，這組ITS1-5.8S-ITS2 引子序列是：
18D（5'- CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3'）和
28CC（5'-ACTCGCCGTTACTAGGTGAA-3'）
PCR複製核糖體核酸基因間隔區的反應物及濃度如下：在0.6 ml的微量離心管內加入10 µl of 10 X reaction buffer，10 µl MgCl2（25 mM），2 µl dNTP
mix (8 mM)，25 uM的18D 和28CC 引子各4 µl，和10 U of Taq polymerase，最後加入4 ul的範本DNA，加無菌水使總體積成100 ul，將微量離心管置入熱循環器。反應的熱循環溫度及時間如下，先以94 ℃反應5分鐘，然後94 ℃反應1分鐘，60 ℃反應1分鐘，72 ℃反應1分30秒的三個步驟進行40個循環，最後72 ℃反應10分鐘後，將PCR複製產物維持在4 ℃下備用。
３、電泳分析
將PCR複製產物進行電泳分析,操作步驟如下:
(1) 取0.6 g瓊膠加入40 ml 0.5 X TBE 緩衝液中。
(2) 在微波爐中加熱2分鐘。
(3) 迅速加入2 ul ethidium bromide （7.5 mg/ml），小心振搖,倒入膠盤。
(4) 瓊膠在10〜15分鐘內凝結。
(5) 加Marker 5 ul（事先加入2 ul dye）。
(6) 加PCR複製產物 5 ul（事先加入2 ul dye）。
(7) 在50 V/100 V電泳槽內進行電泳分離，約30分鐘。
(8) 以紫外燈箱上觀察，並拍照電腦存檔，以便作為判讀與分析之依據。
４、定序
在UV 燈下觀察，以確定其PCR擴增長度正確，於700〜900 bps下得一清晰環帶，再將之交給源資國際生物科技股份有限公司定序(附圖24)。
（３）預期結果
預期的結果，
１.明確的從花、葉、種子、莖等辨識大葉山螞蝗的外部形態。型態特徵以及植物基原鑑定
２.習得PCR的技術，得到rDNA、ITS序列，然後練習判斷編碼區包刮18S、5.8S及26SrRNA。
３.得到大葉山螞蝗的rDNA的ITS的序列，然後可以與其它山螞蝗屬植物比較，得到更準確分辨大葉山螞蝗與其它山螞蝗的差異性
（４）參考文獻：
１.呂福源 等著 臺灣樹木圖誌
２.臺灣藥用植物資源名錄行政院衛生署中醫藥委員會編
大葉山螞蝗 92年10月 250頁
３.甘偉松：藥用植物學，國立中國醫藥研究所
（５）需要指導教授指導內容
山螞蝗屬更仔細的判斷與辨別
PCR的指導與教學
序列的分別與判斷
儀器用途與使用之教學
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